质量表征分析服务

蛋白药物由于分子量是小分子药物的数百倍，且因工艺流程等易引入修饰变化甚至会聚集成颗粒，因此必须在其药物生命周期的不同阶段与生产过程中对其质量表征进行分析以确保药物研发的成功、缩短研发周期。

蛋白质质量表征包括分子大小、电荷、稳定性等。蛋白质结构、溶液组成、环境等，构象或胶体稳定性都可能决定长期的蛋白质稳定性行为。 ACROBiosystems百普赛斯基于UNcle仪器和SEC-MALS仪器搭建了质量表征分析服务平台。基于UNcle多功能蛋白质稳定分析仪可提供溶解温度(Melting temperature, Tm)&聚合温度 (Aggregation temperature, Tagg)值的测定和粒径的测定，具有样品制备简单、无需标记检测、高通量低剂量多参数多功能等特点。基于尺寸排阻色谱法与18角度激光光散射检测器联用的SEC-MALS仪器可以直接计算出分析物的绝对分子量，确定聚体状态与纯度，满足整个药物研发，工艺与过程开发，产品质量控制等环节的检测需求。

两大平台介绍

检测原理

SEC-MALS系统原理

SEC的分离通过在装填有多孔性材料的色谱柱中进行。柱中填料颗粒上的孔有大有小，大分子在通过这种网状凝胶床上的孔隙时被排阻先流出柱子，小分子通过时被滞留后流出柱子，实现按照分子尺寸的大小进行各组分的分离，根据分离谱图得到蛋白纯度。通过SEC（尺寸排阻法）分离后的各组分进入到多角度光散射检测器，激光照射到各组分时会发生光的散射，MALS（多角度光散射）通过多个角度同时测定散射光的强度，散射光强度正比于摩尔质量、浓度、折光指数增量的平方，当散射光强度、浓度、折光指数增量的平方已知后，通过公式可以直接计算出分析物的绝对分子量，从而判断蛋白的聚集形式。

样品类型

重组蛋白

抗体

多肽（需提供柱子和方法）

药典依托

《中国药典》2020版0514分子排阻色谱法

UNcle蛋白稳定分析仪原理

UNcle通过全波长荧光检测蛋白分子中芳香族氨基酸内源性荧光发射属性的改变，进而得到蛋白变性曲线，定量计算出蛋白稳定性参数Tm，反应出蛋白的热稳定性或化学稳定性；采用静态光散射（SLS）技术检测蛋白聚集稳定性，蛋白变性过程中，其构象逐渐打开，疏水位点逐渐暴露，达到一定程度（温度）时，蛋白分子开始聚集，导致散射光信号增加，从而确定蛋白聚集起始温度Tagg。此外，运用DLS（动态光散射），光通过布朗运动的胶体时，粒子的散射光强度会发生周期性变化，通过一定角度下检测到光信号变化，计算出粒径及其分布。

样品类型

Tｍ&Tagg值测定：重组蛋白、单抗、双抗、ADC、AAV和LNP

粒径测定：不限类型（粒径为nm级别即可）

药典依托

《中国药典》2020版0982粒度和粒度分布测定法

服务范围

点此询单

SEC-MALS通过测定绝对分子量可以进行抗体/蛋白纯度及聚集形式的确定和复合物的修饰分析

UNcle可以通过荧光光谱以及DLS技术进行制剂开发/优化/处方筛选、药物候选分子（重组蛋白、单抗、双抗、ADC、AAV和LNP等）热稳定性评估与筛选

案例分享

SEC-MALS案例分享

绝对分子量测定

以上市药物抗体分子量测定为例，比较SEC-HPLC和SEC-MALS的测定结果，我们用SEC-HPLC和MALS两种方法分别测定了OKT3、赫赛汀(Herceptin)和伊匹单抗(Ipilimumab)三种已知分子量的上市抗体药物。如Tab 1所示，三种抗体药物实际具有非常接近的分子量(150-160kDa)，但三者洗脱保留时间却有较大的差异，造成SEC-HPLC计算分子量大相径庭，其中OKT3抗体测定为212.5kDa， Ipilimumab仅为66.3kDa，和真实分子量相去甚远。而SEC-MALS检测三种抗体分子量和抗体理论分子量非常接近(Fig 2)。

由此可见，MALS技术测定蛋白分子量的结果较传统的SEC-HPLC更加准确可靠。

Tab 1. 三种抗体药分子量测定结果

: Fig 1. 不同抗体的SEC-HPLC分子量测定结果

: Fig 2. SEC-MALS测定三种抗体药物的分子量

复合物修饰分析

SEC-MALS可以进行糖基化、PEG修饰蛋白、膜蛋白等复合物组分测定，Fig 3所示为糖基化修饰蛋白复合物组分测定，蛋白复合物摩尔质量（黑色），复合物中蛋白组分摩尔质量（红色），复合物中糖修饰的摩尔质量（蓝色）。

: Fig 3. SEC-MALS测定糖蛋白复合物组分

验证蛋白聚集结构和纯度

S蛋白是新冠病毒研究中最重要的靶标，在病毒表面以同源三聚体形式存在，当S1亚基中的RBD与宿主细胞ACE2结合后，引发三聚体不稳定性，造成S1亚基和S2亚基发生解离，S2亚基的构象变为高度稳定的融合后结构，因此S蛋白具有融合前(Prefusion)和融合后(Postfusion)两种构象。研究人员发现，S蛋白的构象形式很不稳定，即使不与宿主细胞受体ACE2结合，也会自发出现由Prefusion到Postfusion的构象改变，这对疫苗开发和中和性抗体筛选带来巨大的挑战。

Cat. No. SPN-C52H9 (SARS-CoV-2 S protein, His Tag, Super stable trimer (MALS & NS-EM verified)。

: Fig 4. 经还原条件SDS-PAGE验证，SARS-CoV-2 S 蛋白、His Tag、Super stable trimer (MALS & NS-EM verified) (Cat. No. SPN-C52H9)的纯度通过超过90%，经SEC-MALS验证分子量约为550-660 kDa。大小和外观与NS-EM验证与已发表文献中报道的 SARS-CoV-2 三聚体相似。